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以基因轉殖動物產製人體用生醫產品及其品質效能測試

注意事項

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

美國食品及藥物管理局(FDA)

生物評議及研究中心製作

1995

目次

I.              本文件宗旨

II.         管制責任歸屬

III.    基因轉殖動物之定義

IV.         基因轉殖動物世代的建立及系統的特性

A.        基因轉殖及表達系統(藉異型合子生物體表達基因)

B.        藉同源基因重組達成基因轉殖標的(藉同型合子剔除基因表達)

V.              親代(G0)基因轉殖動物模式之建立以及其特徵之描述

A.        基因捐贈動物及代理孕母特性的描述

B.        轉殖基因之導入

C.        轉殖基因親代(G0)動物特性描述

1.      基轉親源動物之分析

2.      遺傳穩定性及表現型

a.    遺傳穩定度

b.    基因表達之穩定度

VI.         建立可靠而持久的基轉動物種源(可靠且持久的種源品系)

VII.    具有生產力畜群世代之遞嬗及選育

A.        基轉動物沿革記載及其宗譜學

B.        繁殖技術

C.        實際進行產品生產之畜群補充新個體時應注意事項

VIII.       轉基因動物品系的維持

A.        監視基轉動物健康狀態

B.        具產能動物之撫育

C.        轉基因動物畜舍之建立

D.        生產製劑之畜群中動物的汰換

E.        基因轉殖動物之處置及副產品利用

F.        檢疫後標兵動物的設置

 

IX.         基因轉殖動物產品的純化及其特性的描述

A.        轉基因動物生醫產品之回收

B.        如何定義產品批次

C.        生化物質(內生性的) 背景值及基轉後(外源性的)上升的

       蛋白質表達狀況

1.      基轉標的動物(the host animal)

2.      提煉產品的原料(為動物的組織source tissue)

3.      病原測定及病原的消除(pathogen testing and

elimination)

D.        產品成份分析及純度化驗

1.      生化物質之組成份、純度、及效力

2.      (不同批的)產品之歧異

E.        終產品整批放行時的品管檢測

F.        「以基因轉殖動物生產組織移殖物」特論

X.              臨床前安全性評估

參考文獻

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

以基因轉殖動物產製人體用生醫產品及其品質效能測試

注意事項

I. 本文件宗旨

  美國藥物及食品管理局(FDA)負責管制人體用藥及人用生物製劑。本文件旨在說明FDA對於利用基因轉殖動物生產人用藥品及生物製劑的立場及顧慮。FDA考量到主管單位接受IND(Investigational New Drug新藥臨床研究申請申報階段)PLA(Product License Application成品藥證申請)ELA(Established License Application藥證建立申請)、或NDA(New Drug Application新藥申請)接受申請時,將會遇到的重大科學問題而訂定基本的規定。本手冊旨在幫助主管單位接受以基因轉殖動物生產之新型生醫產品申請應用於人體時,對於申請單位要求提出之必要科學資料項目。

  本文件針對與基轉動物生產系統相關之藥物、生物製劑、生醫設備、組織及細胞性醫材規範出一套與其他生產系統安全性及效價性相等的規範。本文件標明:轉基因的構建、寄代時遺傳性質穩定傳承的程度,同時也規定應避免產品受到藥物、化學物質、或外來不明物質的汙染。

  可預見針對某些特殊的項目,為了進行足夠的確效工作,所以必須藉嚴謹的科學方法對其定義。許多與醫藥產品相關的事項,與the Center for Biologics Evaluation and Research(CBER)出版的 Points to Consider(PTC)文件(附錄書目第一至第五篇文章)中規定的事項重複,因此皆可引用參考。

 

II. 管制責任歸屬

  大多數由基轉動物生產之人用檢測試劑、預防或治療用產品係以生物產品。生物性質製品(含細胞療法cellular therapies)的管制,是根據公眾健康服務the Public Health Service Act法案(聯邦法規42 U.S.C., Sec. 201 et seq.) 及聯邦食品藥物及化妝品法案the Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (21 U.S.C., Sec. 301 et seq.). 管制之法源在聯邦法規(Code of Federal Regulations, 21 CFR)。非生物性人用醫療產品由the Center for Drug Evaluation and Research(CDER)the Center for Devices and Radiological Health(CDRH)進行管制。

  此外,FDA轄下的獸醫中心Center for Veterinary Medicine(CVM)及食品衛生營養中心Center for Food Safety and Applied Nutrition(CFSAN)、美國農部the United States Department of Agriculture(USDA)等部門負責管制與基轉動物終端產品有關的獸醫、食品之安全及使用事項。21 CFR58, 210, 211, 600, 680部份 9CFR 1, 2, 3部份的法規與動物的產製或最終處置有關。

 

III. 基因轉殖動物的定義

  基因轉殖動物指人為利用基因重組技術改變動物體中遺傳物質狀況。基因改變後的動物分為二種,第一為生殖細胞遺傳上的改變使表現型的變化隨著世代傳遞而代代相傳。第二為僅改變體細胞遺傳物質,而因生殖細胞並未發生遺傳物的變化所以並不會代代相傳。第一種基轉動物包括利用配子細胞先取出到體外操作(ex vivo)、或早期胚胎時期的操作或胚胎幹細胞的操作。第二種操作的例子如利用動物體細胞、經過基因療法(gene therapy)手段(如:直接注射質體DNA或經由病毒將基因轉移到體細胞)。基因轉殖提到一段重組的DNA,該段DNA 1)被引介入體細胞之中 或 2)穩定地整合進入到標的動物品系的生殖細胞中,並於該品系世代傳承時,轉機音特性仍能穩定地保留於各子代之中。

 

IV. 轉殖基因動物系統之建立及系統特性的確認

  基轉動物使用重組DNA技術後,為了確定最終產品合乎預期效果,必須對於該基因轉殖系統進行特性的確認。轉基因系統的細部詳情及品質控制資料須經過彙整,在眾多轉基因品系中,進行單一種源挑選(也就是cloning)、品系純正血統的維持(種系淨化purification)、並對系統種系進行最後的特徵確認。第三份列出的參考文件:The Supplement to the Points to Consider in the Production and Testing of New Drugs and Biologicals Produced by Recombinant DNA Technology: Nucleic Acid Characterization and Genetic Stability其中利用系統表現出的重組蛋白質來確定基因轉殖的效果。

 

A.    基因轉殖與表達系統(異型合子、功能獲得)

工作人員須先將欲置換或添加的基因特性詳加敘述。必須在文獻中描寫原先該基因所編碼蛋白質表達的形式。挑選以及單離該基因的方法應加以報告。文件中應附以適當程度的基因圖譜及基因序列(不論該序列為已發表或最新定序而尚未發表者)。較長段載体上的DNA序列,如:酵母菌人造染色體(YAC),若是尚未訂定全部序列,則應利用詳細的限制酶圖譜以定義。這些例子中,cDNA核苷酸序列或可(should be)藉著前述資訊以決定。

所有參與建構本系統的基因片段、載體基因應以限制酶圖譜及核苷酸序列描述。基因調控片段來源及特徵是文件中的重點。焦點為:enhancerspromoterssuppressors。文件中應明載建立系統時特意去除之某些強效基因調控片段。此外,也應載有轉入系統中的新穎之轉錄因子。

 

B.    等位基因重組(功能剔除)

等位基因重組技術,可以針對動物基因之特殊區域進行基因置換。藉著阻斷或移動基因片段可以將某基因功能消除。對於剔除基因後引起表現型之變化狀況,必須特別加以指明。已經有數項基因剔除實驗呈現出不同程度功能喪失的情況(單一基因置換並不能完全使生物個體失去某表現型功能),生物體可利用數種機制以補救標的基因功能缺失。因此,找到與標的基因相關、潛在之可彌補基因置換功能產物存在的實証將為研究上的重要事項。

 

V. 轉基因親代(G0)動物建立及系統特性之描述

A. 基因捐贈者以及代孕母動物的特性

捐贈配子或胚胎幹細胞之動物、代理孕母或接受基因轉殖動物需詳述下列參數:種類、品系(尤指人為傳代的動物品種)、動物進口國、一般健康狀況、及其他可供利用的親譜訊息。實驗動物應經過獸醫詳細檢查,並且應對於品種及品系特有的疾病進行特別仔細的檢查。應避免由海綿狀腦病疫區進口可染病品種之動物進行實驗。捐贈基因畜群與接受基因轉換的畜群都應以同等嚴苛的標準,進行排除外來污染物質的篩選,以產生適當的基轉畜群。

 

B.  轉殖基因導入的方法

  應儘可能詳述基因轉殖進入細胞方法之細節。例如:在使用改變生殖細胞基因以建立基因轉殖生物生產系統時,所採用的:卵細胞的分離、體外授精、囊胚或是胚胎幹細胞的顯微注射、 胚胎的發育、胚胎移植、以及其他以建立成熟或新奇的技術。對個體體細胞進行操作以製造基轉動物的技術也應詳細加以敘述。

 

C.  轉基因動物親代(G0)系統特性的描述

1. 基因轉殖親代動物的分析                       

  須對於親代轉基因動物及後續子代動物品系之特性進行分析,相關文件中必須載明分析的結果。應建立親代基因轉殖動物對於檢測靈敏之感受性質。建立及處理用於人體食品用途、或是用於人用食品檢測的基轉動物系統時,應當符合FDA相關的規定(CFSAN藥物評價研究中心或CVM獸醫中心)USDA(美國農業部)食品安全及檢驗服務部門(FSIS)所訂定的相關規定。(請見第VIII.E.部分的說明)

  親代動物必須以嚴格的規定描述。基轉動物於各種季節各種年齡或其他變因下所發生產量的變化也應於報告書中說明。基因轉殖表達於特定組織區域、表現於特定時期,這些參數都應進行確效。基因轉殖後之組織進行加工後也需要進行品管。基轉產品可能會出現在非自然生產該類物質的組織,因此也會產生異於平常的轉譯後修飾蛋白質。因為加工程序會隨材料變化,所以必須對其生物及免疫學上的影響進行評估。大量生產轉基因蛋白質也可能造成不良的副作用。

 

2. 穩定的基因轉殖以及穩定的基轉表達

  要持續獲得穩定的轉基因產品,必須先穩定轉殖基因參數。這些變數是:轉殖基因結構、轉殖基因之表達其可利用程度必須維持完整、穩定。親代動物經身分認證,其用於生產的子代動物必須保持上述變數穩定,在養殖數代後還要確認轉殖的基因未發生不穩定現象。

 

a.    穩定的遺傳現象

製造基轉親代動物時,轉入的基因以複數值嵌入其生殖細胞染色體,基因轉殖過程中,會發生基因重排、基因流失等現象。因此,經過數代交配傳承後動物轉基因的穩定性,必須以適當的監控方法,如:Southern Blots南方轉漬法、基因定序及其他方法。在基轉動物繁殖數代之後,必須確定仍有數份轉基因拷貝存在染色體當初插入基因所在處。上述的方法也可以用於copy number stability、未發生基因重組現象、或序列遺失等現象的品管工作。基轉品管過程最好於親代動物建立過程中就要展開,若使用的動物品種不易進行上述品管,則需研究交配品系、或於繁殖數代後監測其限制酶圖譜。這些品管方法同樣可以應用於基轉動物繁殖品系轉殖基因的穩定度及監控基因片段拷貝減失的狀況。

 

b.    基因表達的穩定度

基因轉殖產物表達狀況,可能會依照親代動物原有遺傳物交互作用、或母系動物印痕(imprinting基因印記現象,可能是由母系或父系單基因多表現型擇一表現)而產生變異,因此,建立了轉基因親源動物後,從其中挑選作為後續生產體系的個體來源時,就應該開始監測其轉基因的穩定度,並持續數代。生產單位對於轉基因變化之上下限要訂出可接受範圍,並運用在建立完備生產用的轉基因畜群。生產文件中,(當實際操作可行時)最好能夠包含轉錄層次各組織或細胞中RNA表現的量如:轉錄的程度、轉基因後轉錄呈現的相對值(不是RNA的絕對值,但是基準並未明定)、轉錄所在的組織或細胞等數據及資料。檢測的方法包含:北方轉漬法Northern blots,反轉錄聚合酶鏈鎖反應RT-PCRDNase protection assay或其他適當技術。不同譜系血緣轉基因動物生產轉基因產品過程中,需監測產量及轉基因表達的水準,不符合最低表達標準的生產品系即予以淘汰。最低生產標準制定的原則:所生產轉基因產物,不論其將來會做為產品主成分或產品輔成份,其材料濃度必須達到純化最低需求。

 

VI. 建立可靠且可持續生產的轉基因動物生產系統(轉基因親代動物的建立)

 

  轉基因動物無法像一般細胞庫般永久性保存種源,所以當親源動物種系建立完成後,下一步就是維繫該品系、確保一段較長的時期,而在該時期中轉基因動物的來源穩定且不虞匱乏。建立維繫親源動物血脈的育種方法時,應考慮到交配時可能會影響種源動物遺傳性質的因素:交配對象的基因(身世background)是否可能會影響到交配後所產下一代畜群的遺傳特性,而造成子代所生產的轉基因產物的量、質、以及純度發生變化。目前已訂定的、以細胞層次生產基因轉殖產品之規範:The Points to Consider in the Characterization of Cell Lines to Produce Biologicals(生醫生產用細胞株定性要點,第四篇參考文獻)可以作為發展本轉基因動物生產系統定性之規範。該要點用來定義生醫細胞庫(cell bank)建立及其概念基礎。並且規範中使用的是一種逐級遞選(篩選)的定性系統。底級為the Master Cell Bank(主細胞庫,MCB),其中保存的細胞自來源細胞無性生殖、且繼代代數不多、同質性極大的、始祖性的細胞群。第二群為the Manufacturers Working Cell Bank ( 操作型細胞庫,MWCB)

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